产品货号：
BTN14-29000
中文名称：
猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)
英文名称：
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RT-qPCR Kit(SYBR)
产品规格：
50次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本产品基于PCR原理开发。
猪生殖与呼吸综合症是由病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病。其主要特征为母猪发热，厌食，妊娠晚期流产，死产，产木乃伊胎，仔猪有呼吸道症状和高的死亡率。因此猪生殖与呼吸综合症病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。
保存：-20℃，有效期一年。
一、稀释阳性对照(以102～107这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
二、样品RNA的制备
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
四、数据处理
相关搜索：猪生殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)荧光定量RT-PCR试剂盒(染料法)
猪生殖与呼吸综合症是由病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病。其主要特征为母猪发热，厌食，妊娠晚期流产，死产，产木乃伊胎，仔猪有呼吸道症状和高的死亡率。因此猪生殖与呼吸综合症病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。
- 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
- 根据猪生殖与呼吸综合症病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
- 基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10～100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
- 使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
- 本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。
| 组分 | 规格 |
| 2×qRT-PCR缓冲液 | 500μL |
| 10×qRT-PCR酶混合液 | 100μL |
| ROX染料I，50× | 20μL |
| ROX染料II，50× | 20μL |
| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1mL |
| 猪生殖与呼吸综合症病毒通用染料法qRT-PCR引物混合液 | 100μL |
| 猪生殖与呼吸综合症病毒通用染料法qRT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL) | 50μL |
保存：-20℃，有效期一年。
一、稀释阳性对照(以102～107这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
- 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
- 在7号管中加入5μL 1×108拷贝/μL的阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×107拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在6号管中加入5μL 1×107拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×106拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
- 换枪头，在5号管中加入5μL 1×106拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×105拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
- 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×104拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
- 用自选方法纯化N+2个样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送20次免RNA提取的核酸释放剂试用装，其使用手册可以从本公司网站www.bjbalb.com，通过搜索产品名称核酸释放剂或产品货号BTN61202下载。
三、设置RT-PCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)
- 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
- 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加)：
注：成分 样品管
N+2个RT-PCR
阴性对照RT-PCR阳性对照
(2～7管)2×qRT-PCR缓冲液 10μL 10μL 各10μL 猪生殖与呼吸综合症病毒通用染料法qRT-PCR引物混合液 2μL 2μL 各2μL 50×ROX(见注) 0.4μL 0.4μL 各0.4μL 样品制备所得RNA模板(来自于第8步) 5.6μL 不加 不加 稀释所得6个阳性对照(来自于第6步) 不加 不加 各5.6μL 10×qRT-PCR酶混合液 2μL 2μL 2μL
需使用ROX染料I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用ROX染料II的机型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。 - 上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 温度 时间 RT(逆转录) 50℃ 2min 预变性 95℃ 10min RT-PCR反应
(40个循环)95℃ 15sec 60℃ 1min(采集FAM通道的荧光信号) 按仪器预设程序进行熔解曲线分析
四、数据处理
- 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35～40之间，则重复一次。
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